奥克托今(HMX)具有八元环的硝胺结构, 是现今综合性能最好的炸药, 其具有良好的爆炸性能而被广泛应用于导弹、核武器和反坦克导弹的战斗部装药。生产使用HMX过程中的不恰当操作使工厂周围的环境受到严重污染, HMX具有显著的毒性, 美国环境保护署已经将其列为优先控制污染物名单[1]。
国内外处理HMX废水的常用方法包括光催化[2]、超临界水氧化[3]、三维电解法[4]、纳米零价铁处理炸药废水[5]以及微生物处理等。物理化学方法一般仅适于浓度较高的有机废水处理, 对浓度较低的有机废水处理效果差且成本高。微生物法具有高效、环境友好、处理成本低等特点, 一直是研究的热点方向。目前已经分离得到降解HMX的菌种有:硫酸还原菌(Desulfovibrio spp)[6]、摩根菌摩氏菌(Morgenella morganii)和雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)[7]和克氏梭状芽孢杆菌(Clostridium kluyveri)及曲霉菌(Aspergillus niger)[8]等。这些菌种均能降解HMX, 但只能在严格好氧或严格厌氧条件下进行, 降解时间较长, 而且还会引起其他物质的积累。因此, 这些因素限制了它们进一步应用。
光合细菌在不同供氧光照的条件下均可降解有机物, 而且它所要求的条件也不像一般的专属好氧菌和专属厌氧菌那样严格[9]。特别是紫色非硫细菌不仅能在厌氧光照的条件下进行光能异养生长, 而且能在好氧黑暗条件下进行好气异养生长。光合细菌这种随着生存环境而灵活改变代谢类型的特性, 较其他微生物材料具有优越性[10]。为此, 国内外对光合细菌进行了广泛的研究, 并成功处理了炸药(如: 2, 4, 6-三硝基甲苯和2, 4-二硝基甲苯)[11]、农药、含氯苯酚、氯苯[12-15]等废水。然而用光合细菌处理HMX的研究国内外却鲜见报道。本研究初次采用球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)降解HMX, 研究了不同理化因素对驯化的球形红细菌降解HMX能力的影响, 并对其降解动力学过程进行了拟合分析, 为该菌株在杂氮化合物废水污染治理中的应用提供参考。
2 材料与方法 2.1 材料菌种:球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)H菌株系紫色非硫菌群红细菌属光合细菌, 由山西大学光合细菌研究室分离、鉴定并保存[16]。
基础培养基:酵母膏1.0 g, MgSO4 0.2 g, CaCl20.07 g, (NH4)2SO4 1.25 g, 苹果酸2.5 g, KH2PO4 0.6 g, K2HPO40.9 g, 蒸馏水1000 mL, pH 7.0;驯化培养基:基础培养基加适量HMX。
试剂: HMX, 99%, 购自阿拉丁公司。
2.2 方法 2.2.1 菌种的驯化将10%原始菌液接入HMX含量为100 mg·L-1的驯化培养基, 在30 ℃、2500 lx光照培养箱中厌氧驯化培养10 d作为驯化菌种。
2.2.2 球形红细菌H菌株降解HMX实验球形红细菌生长与HMX降解实验均在密封无菌条件下进行, 将10 mL驯化后的菌悬液10000 r·min-1离心10 min, 弃上清液, 菌体用磷酸缓冲液洗涤2次后, 用培养基制备成菌悬液, 备用。在HMX浓度为100 mg·L-1的基础培养基中, 接种15 mL的菌悬液(细胞生物量OD值为0.551), 用1 mol·L-1的HCl和NaOH溶液分别调节pH至7.0, 在温度30 ℃, 厌氧光照条件(血清瓶装满培养物, 盖橡皮塞, 光照度: 2500 lx, 静置)培养0, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 h后。离心菌体10 min(转速10000 r·min-1), 测定上清液中剩余HMX浓度, 确定菌种对HMX的降解效率:
| $ \eta = ({C_0} - C)/{C_0} \times 100\% $ | (1) |
式中, η为去除率, %; C0为初始浓度, mg·L-1; C为剩余浓度, mg·L-1。用等量蒸馏水制备的菌悬液, 于波长590 nm处测定OD值, 以测定其生物量。同时, 为了证明球形红细菌可以降解HMX, 设置不同体系:分别进行4组平行试验: (1)含有100 mg/L HMX和球形红细菌的培养基; (2)只含有100 mg/L HMX的培养基; (3)含有100 mg·L-1 HMX和灭活球形红细菌的培养基; (4)在蒸馏水中含有HMX 100 mg·L-1和球形红细菌。通过接种一定量的球形红细菌, 使培养基中的细菌数量达到1.5×106 cells·mL-1。用橡胶塞将血清瓶密封置于30 ℃的光照培养箱中, 光照强度为lx 2500。每隔12 h取2 mL菌液, 10000 r·min-1离心10 min取上清液。
供氧光照培养条件对菌株生长和降解HMX效率的影响:按照上述的实验方法, 设置4种培养条件:厌氧光照、厌氧黑暗、好氧光照和好氧黑暗, 光照度为lx2500, 好氧时采用摇床(振荡速度为130 r·min-1)黑暗(用7层黑布包裹), 培养96 h后, 取样分析。
不同底物浓度、接种量pH值和温度对菌株降解HMX效率的影响:按照前面介绍的实验方法, 分别考察不同底物浓度(75, 100, 125, 150 mg·L-1)、接种量(5%、10%、15%、20%和25%)和pH(5、6、7、8和9), 温度(20, 25, 30, 35, 40 ℃)对菌株降解HMX的效率的影响及动力学过程。规定条件为: HMX初始浓度为100 mg·L-1、pH 7. 0、接种量为15% (体积分数)、温度为30 ℃。实验过程中, 改变1个影响因素, 固定其它3个条件, 进而确定适宜降解条件。
2.3 测试方法用UV-2102PC型紫外可见分光光度计(UNICO)在最大吸收波长590 nm处测定菌液浓度(OD590 nm)。
用可见光分光光度法测定HMX的浓度[17]。
3 结果与讨论 3.1 球形红细菌H菌株对HMX的降解球形红细菌H菌株在HMX初始质量浓度为100 mg·L-1培养基中的生长情况及其降解HMX的关系如图 1。由图 1可以看出, 当降解24 h, HMX质量浓度为72.3 mg·L-1, HMX的降解率为30.0%;当降解48 h, HMX质量浓度迅速降低为31.3 mg·L-1, 降解率达到68.7%;当降解72 h, HMX质量浓度明显降低, 为17.2 mg·L-1, 降解率达到82.8%。随着菌株进入对数生长期(36~72 h), HMX的降解效率显著升高; 之后随着时间的增加, 降解效率趋于平稳, 到达96 h时, HMX降解率达到了88.9%。分析原因可能为由于营养成分的缺失和代谢物的增加, 菌株生长逐渐至衰退期, 对HMX的降解能力也随之下降, 降解曲线趋于平缓。
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图 1 球形红细菌生长和降解HMX的曲线 Fig.1 The curves of Rhodobacter sphaeroides growth and HMX degradation |
四种体系(在培养基中的球形红细菌; 只有培养基的条件; 灭活的球形红细菌; 在蒸馏水中球形红细菌)对100 mg·L-1 HMX的降解影响如图 2所示。由图 2可见, 在球形红细菌的作用下可降解HMX, 在96 h降解率达到88.9%;灭活的H菌株并未对降解HMX产生显著的影响; 在只有培养基的对照试验中, HMX含量也无较大变化。由此可认为, 降解HMX并不是由培养基或细胞吸附引起的, 降解HMX主要是通过球形红细菌的生物降解过程。
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图 2 不同体系对HMX降解的影响 Fig.2 Removal of HMX in different systems |
在HMX初始浓度为100 mg·L-1, pH值为7, 温度为30 ℃和接种量为15%的条件下, 在96 h不同的光照和供氧对球形红细菌的生长和HMX的降解效果影响见表 1。由表 1可见球形红细菌在不同供氧光照条件下均可以降解HMX。在厌氧光照条件下, 96 h菌株对HMX的降解率达到最高, 为88.9%, 且菌体生长最好, OD值达到2.128;其他条件下, 96 h菌株对HMX的降解率也达到70%以上, 菌体生长OD值均达到1.1以上。分析原因可能为, 球形红细菌在不同生长环境下具有灵活改变代谢的特性[18], 最适降解条件为厌氧光照。因此选择在厌氧光照的培养条件下进行降解实验。
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表 1 不同光照供氧对H菌株生长及HMX降解率的影响 Tab.1 Effect of different illumination and oxygen supply on H strain growth and HMX degradation |
HMX在不同初始浓度下对降解的影响见图 3。由图 3可见, HMX浓度变化对球形红细菌降解HMX效率的影响十分显著。当HMX的初始浓度由75 mg·L-1升高到100 mg·L-1时, 降解速率随着时间的变化在升高。初始浓度从100 mg·L-1升高到150 mg·L-1降解速率逐渐随降低。在初始浓度为100 mg·L-1时降解效率最佳为88.9%。在96 h各浓度的降解率分别为74.7%、88.9%、60.0%和20.0%。分析原因可能为两种, 其一球形红细菌的数量是有限的, 降解效率不会随着HMX浓度的增加而一直增长[19]; 其二HMX在低浓度时可作为碳源、氮源, 利于细胞生长, 当HMX浓度进一步升高为150 mg·L-1, H菌株降解HMX能力大幅度下降, 说明过高浓度的HMX可能会抑制菌群的生长。因此选择降解HMX的最适初始浓度为100 mg·L-1。
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图 3 HMX不同浓度对降解的影响 Fig.3 Effects of different concentrations of HMX on the degradation |
不同接种量对HMX降解的影响见图 4。由图 4可见当接种量由5%增加到10%时, 随着时间的增加, HMX降解率也随之增加。当接种量从10%增加到15%时, HMX的降解率上升并在15%时达最高，为88%。当接种量从15%增加到25%时，HMX的降解率逐渐降低。分析原因可能为当接种量低于10%时, 细胞依靠培养基中的营养成分生长, 细胞需要较长时间来产生大量感应信号分子来满足激活应答的浓度要求, 导致菌株降解HMX的效率低下。当接种量从10%到15%时, 球形红细菌在一定程度上能以HMX作为其生长的营养成分, 进行共代谢。继续增大接种量, HMX降解率基本趋于稳定状态, 此时接种量已不再是影响HMX降解率的主要因素, 这可能由于细菌群感效应造成的, 细胞之间的信息交流与浓度有着密切的关系, 只有当细胞产生的感应信号分子达到一定浓度的时候, 才能激活细胞对环境的应答[20]。
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图 4 不同接种量对HMX降解的影响 Fig.4 Effects of different inoculation quantity on the degradation of HMX |
不同pH值对HMX降解效果的影响见图 5。由图 5可见, 当pH值为5.0和9.0时, 球形红细菌对HMX降解几乎没有作用, pH值为6.0~8.0, HMX的降解率都大于80%, 当pH值为7.0时, 96 h菌株H对HMX降解率达到88.9%。结果表明, 厌氧微生物在pH值为6.0~8.0时能达到最佳生长条件[21]。球形红细菌对pH值敏感, 过酸或过碱的条件都不利于球形红细菌的生长和对HMX降解。分析其原因可能有两点, 其一由于pH值改变, 引起细菌表面电荷改变, 进而影响细菌对HMX的降解; 其二, 氢离子浓度也会影响代谢过程中酶的活性[22]。pH值对微生物的生长代谢具有重要作用, 能够影响微生物细胞内的酶活性及代谢产物的生物活性[23]。所以确定菌群降解HMX的最适pH值是必要的。因此, 降解HMX的最佳pH值为7.0。
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图 5 不同pH值对HMX降解的影响 Fig.5 Effects of different pH values on the degradation of HMX |
不同温度对HMX降解效果的影响见图 6。由图 6可见, 在HMX初始浓度为100 mg·L-1, pH值为7.0, 培养96 h情况下, 当温度为20 ℃和40 ℃时, 球形红细菌对HMX的降解几乎没有影响; 当温度为30 ℃时, 降解率可达88.9%;当温度低于25 ℃或者高于35 ℃时, 降解率出现了明显的下降。球形红细菌降解HMX的最适温度为30 ℃左右。分析原因可能是温度与菌株的生长情况有一定正相关性, 即在适宜温度条件下, 生长较好的菌株产生较多的降解酶, 加速电子传递。此外, 温度的变化还会引起细胞生存稳定性的改变[24]。低温或者高温体系可能会使降解酶失活甚至变性, 进而影响HMX的处理效果, 这可能是由于环境温度会影响微生物膜的液晶结构、酶及蛋白质的合成与活性, 进而影响微生物的生命活动[25]。因此, 对于球形红细菌H菌株降解HMX的适宜温度是30~35 ℃。这与屈超[26]等人的研究结果一致。
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图 6 不同温度值对HMX降解的影响 Fig.6 Effects of different temperature values on the degradation of HMX |
一级动力学方程在污染物的生物降解研究中被广泛应用[27]。本研究选用一级动力学模型来模拟对HMX降解的动力学过程。
| $ {c_t}/{c_0} = {{\rm{e}}^{ - kt}} $ | (2) |
式中, c0为初始HMX浓度, mg·L-1; ct为t时刻HMX浓度, mg·L-1; t为降解时间, h; k为反应速率常数, h-1。方程拟合度由R2进行评估。将不同条件下动力学实验数据通过一级动力学模型进行拟合, 可得到不同条件下H菌株对HMX降解的动力学方程, 结果见表 2。
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表 2 HMX在不同初始浓度下球形红细菌降解HMX的动力学方程和动力学参数 Tab.2 Kinetic equations and kinetic parameters of the degradation of HMX under different initial concentration by Rhodobacter sphaeroides |
由表 2可看出本试验条件下的降解动力学在一定程度上符合一级动力学特征。随着初始浓度的稳步增加, 从75 mg·L-1增加到150 mg·L-1, 降解率常数迅速从0.2405减小到0.0304 h-1, 而半衰期从2.9增加到22.8 h。当HMX浓度为100 mg·L-1时, 速率常数最大, T1/2仅为2.5 h; HMX浓度为125 mg·L-1, k降低, T1/2增至5.4 h; HMX质量浓度为150 mg·L-1时, 降解效果出现明显下降, k迅速降至0.0340 h-1。结果也表明, 在HMX的生物降解过程中, HMX既是反应的基质, 同时也是抑制剂。
不同接种量下球形红细菌对HMX降解动力学参数结果见表 3。由表 3可见接种量的降解率常数与半衰期呈相反的变化趋势, 接种量从5%增至15%可以显著提高球形红细菌对HMX的降解率。在接种量为15%时, 降解速率常数最大, T1/2是最小。同样, 由不同pH值下球形红细菌降解HMX的动力学参数结果见表 4, 当初始pH值从5.0增加到7.0再到9.0, 速率常数从0.0112 h-1增加到0.2766 h-1最后下降到0.0115 h-1, 半衰期由61.9 h降至2.5h再增至44.7 h。在pH值为7时, 速率常数最大, 半衰期最小。可见当pH值为7时, 降解率最高, 说明HMX降解的最适pH值为7。由表 5可见, 当温度从20 ℃升高到30 ℃降解率常数逐渐增大, 在30 ℃时, 速率常数最高, 而从30 ℃下降到40 ℃逐渐减少, 速率常数明显下降。当温度为30 ℃时降解明显。
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表 3 不同接种量下球形红细菌对HMX降解动力学参数 Tab.3 Kinetic parameters of the degradation of HMX under different inoculation quantity by Rhodobacter sphaeroides |
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表 4 不同pH值下球形红细菌降解HMX的动力学参数 Tab.4 Kinetic parameters of the degradation of HMX under different initial pH by Rhodobacter sphaeroides |
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表 5 不同温度下球形红细菌降解HMX的动力学参数 Tab.5 Kinetic parameters of the degradation of HMX under different temperature by Rhodobacter sphaeroides |
(1) 驯化后的光合细菌球形红细菌H菌株具有较高的细胞活性, 能高效降解HMX。该菌株在不同供氧光照条件下均可以降解HMX, 但是, 在厌氧光照条件下, 降解最佳。H菌株降解HMX主要是通过球形红细菌的生物降解过程。
(2) 初始HMX浓度、接种量、pH值和温度对HMX降解效果有不同程度的影响。该菌株降解HMX的最适条件为:在厌氧光照的条件下, 初始浓度为100 mg·L-1、pH 7.0、接种量为15%和温度为30 ℃, HMX的降解率达到88.9%。
(3) 在初始浓度为75~150 mg·L-1、接种量为5%~25%、pH值为5~9, 20~40 ℃, 光合细菌球形红细菌降解HMX的规律符合一级反应动力学方程。
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According to the relationship between Rhodobacter sphaeroides growth and degradation of HMX, the optimum degradation conditions of initial concentration, inoculationt, pH value and temperature were determined. The kinetics of degradation was fitted and analyzed.